Lignée cellulaire moc2

Lignée cellulaire moc2

Protocoles de culture tissulaire de laboratoire Uppaluri pour les lignées cellulaires MOCMise à jour 12.12.16

Matériaux nécessaires (voir le protocole IMDM ci-joint pour les réactifs nécessaires pour fabriquer des supports de ligne IMDM MOC)

Sigma Aldrich : DMSO: D2650-100ml

FisherScientifique :

T150Flacons : 07-200-64

Flacons T75 : 10-126-37

Cryovials : 03-374-059

Filtres 45um : : 09-754-21

05% Trypsine : sh30236,01

25% Trypsine : sh30042,01

Lignes Indolent – MOC1, 22

Lignes agressives – MOC2

Lignes cellulaires de dégel

1. Ajoutez 21ml de milieu de ligne IMDM MOC à un T150 avant le décongel (ou 10ml à un T75 si vous voulez décongeler en aT75)

2. Retirez cryovial de l'azote liquide, flacon de pulvérisation avec 70% d'alcool pour le nettoyer.

3. Gardez la moitié inférieure de cryovial dans 37Cwaterbath (sans laisser le couvercle toucher l'eau, pour éviter la contamination) jusqu'à ce qu'il y ait un petit morceau de glace flottant.

4. pulvériser cryovial à nouveau avec ETOH et placer dans le capot. Pipettez 1 ml de milieu dans le 1 ml de cellules et ajoutez ces 2 ml au T150 qui contient déjà du milieu (pour un total de 22 ml pour un T150).

5. Prenez quelques médias déjà dans le flacon T150 et rincez la plaque cryovialand cela pour vous assurer que vous avez toutes les cellules résiduelles laissées dans la cryoviale.

Lignes cellulaires de congélation:

Travailler rapidement, car le DMSO est toxique pour les cellules

Pour chaque flacon T150 avec une confluence cellulaire de 70 à 80 %, congeler 3 à 4 flacons.

1. Cellules récoltées à partir de T150 comme indiqué ci-dessous

2. Spin en pellet dans un tube conique de 15 ml (1000 RPM x 5 min)

3. déverser le surnageant

4. Tapez le tube conique de 15ml pour suspendre les cellules

5. Ajouter 1,5 ml de médias de ligne IMDM MOC, reconstituer les cellules dans les médias - garder sur la glace

6. Ajouter 1,5 ml de milieu de congélation goutte à goutte lentement pendant que le tube est sur la glace

Pour faire des médias de congélation – 20% de DMSO dans les médias de ligne IMDM MOC. Ex: Pour le stock de 20 ml - ajouter 16 ml de média de ligne IMDM MOC et 4 ml de DMSO. Filtre seringue en utilisant le filtre .45um

7. Aliquota 1ml chacun à 3 cryovials

8. Entreposez en -80C pendant pas plus de 2 semaines.

9. Placez dans l'azote liquide dans les semaines 1-2.

Remarque: Si désiré, peut augmenter à 2 ml IMDM et 2 ml de milieu de congélation à stocker dans 4 flacons. En outre, une bonne idée de compter les cellules et d'enregistrer sur le flacon avant de congeler les cellules.

Lignée cellulaire moc2

Caractéristiques de la lignée cellulaire:

Indolent - MOC1 : moins agressif basé sur des études in vivo. Si vous passez 1:12 à partir de 80% de confluence T150, il faut 2-4 jours pour atteindre 80% de confluence. Les lignées cellulaires MOC1 prennent plus de temps pour sortir du flacon lors de la récolte par rapport aux lignées cellulaires plus agressives.

Aggressif - MOC2 : plus agressif basé sur des études in vivo. Si le passage 1:12 de 80% confluent

T150, prend 2-4 jours pour atteindre 80% de confluence. Les lignées cellulaires agressives sortent du ballon beaucoup plus facilement que les lignées indolentes.

Récolte et passage de cellules à partir de T150, 80% de confluence:

1. Verser le milieu de T150 dans le flacon

2. Laver une fois avec 10-20ml de PBS. Verser le lavage PBS.

3. Ajoutez 1,5 ml de trypsine à 0,05%, bouton de pointe pour s'assurer que la trypsine couvre toute la surface et touche ainsi toutes les cellules (faites-le rapidement pour que les cellules ne soient pas exposées à la trypsine trop longtemps), déversez la trypsine, puis réappliez un autre 1,5 ml de trypsine à 0,25%.

4. Placez dans un incubateur 37C. Incuber pendant 3-4 minutes pour les lignées cellulaires agressives et pourrait prendre jusqu'à 10-12 min pour l'indolente mais vérifier après 6-8 min.

5. Tapez le côté du flacon contre la paume de la main délibérément plusieurs fois pour desserrer les cellules

6. Vérifiez sous le microscope pour voir si les cellules flottent librement dans les médias. Si la plupart ne le sont pas, remettez-le dans l'incubateur 37C pendant 3-5 minutes de plus. Essayez de ne pas laisser les cellules rester dans la trypsine trop longtemps car cela tuera les cellules.

7. Une fois que toutes ou la plupart des cellules sont flottantes, ajoutez 10 ml de milieu de ligne IMDM MOC pour neutraliser la réaction.

8. Pipette des médias et des cellules du ballon dans une cellule conique à pellets de 15 ml. Centrifuger à 1000 tr/min x 5 min.

9. Verser le surnageant.

10. Pour passer les cellules à 1:12 - resuspendre les cellules dans un autre 12 ml de milieu.

11. Prenez 1 ml de cela et placez dans un nouveau flacon T150 avec un volume total de 22 ml de milieu de ligne IMDM MOC (dilution 1:12)

12. Remplacer dans l'incubateur 37C pour pousser. Devrait atteindre 80% de confluence en 2-4 jours.

Injection dans le flanc de souris (hétérotopique):

Concentration cellulaire nécessaire :

MOC1, MOC22 : (injecter 1e6 cellules dans 0,15 ml) = 6,66e6 cellules/ml MOC2 : (injecter 1e5 cellules dans 0,15 ml) = 6,66e5 cellules/ml

1. Les cellules récoltées avec 0,25% de trypsine comme indiqué ci-dessus.

2. Après avoir neutralisé la trypsine avec des médias de ligne IMDM MOC, faire tourner la cellule en pellet (1000 RPM x 5 min) dans 50ml conique. (Remarque: utilisez 50ml conique pour permettre à l'aiguille de petit calibre de tirer les cellules pour

injection.

3. Laver les cellules en ressuspendant les granules cellulaires dans 10 ml de PBS froid glacé (en s'assurant d'enlever autant de médias contenant le FCS que possible), tourner la cellule en granules à nouveau (1000 RPM x 5 min)

4. Lavez les cellules à nouveau en ressuspendant les granules cellulaires dans 3-6 ml de PBS froid à glace (le volume est déterminé par la taille des granules, car vous utiliserez ce volume pour compter les cellules)

5. Compte cellsperml en utilisant hémocytomètre ou compteur cellulaire automatisé, en utilisant bleu trypan pour

éliminer les cellules mortes. En utilisant le nombre total de cellules présentes (cellules/ml x ml total de PBS), calculer le volume nécessaire pour suspendre les granules cellulaires pour atteindre une concentration de 6,66e6 (MOC1, MOC22) ou 6,66e5 cellules/ml (MOC2).

Par exemple, pour MOC1, le nombre de cellules est: 2,8e6 cellules/ml x 5ml (PBS) = 14e6 cellules totales. Cellules 14e6 / cellule 6,66e6 / ml = 2,1 ml de PBS pour suspendre les granules cellulaires.

6. Faites tourner les cellules en pellet à nouveau. Verser le surnageant PBS (sans aspiration par pipette). Resuspender les granules dans le volume calculé de PBS froid glacé nécessaire pour atteindre le

concentration, en gardant à l'esprit qu'il y aura ~ 200ul restant dans le conique de 50ml après verser le surnageant.

7. Transférez 50ml conique dans la glace et injectez 0,15ml (150ul) de cellules par souris dans le flanc sous-cutané.

8. Injectez les souris par protocole standard. Nous utilisons une seringue de 1 ml. Nous dressons des cellules à l'aide d'une aiguille de calibre 21 de 1,5 pouce et changeons l'aiguille à une aiguille de calibre 26 de ½ pouce pour injecter.

Protocole pour médias 1L