Collagène alpha - 1 XV (col15a1) Kit humain

Collagène alpha - 1 XV (col15a1) Kit humain
Introduction
Le collagène alpha - 1 XV (col15a1) est une protéine codée par le gène col15a1. Le gène Code pour la chaîne alpha du collagène de type XV, un membre de la famille facit des collagènes (collagènes fibreux avec hélice interrompue). Le collagène de type XV a une large distribution tissulaire, mais il est exprimé dans la région de la Membrane basale, de sorte que sa fonction pourrait être de fixer la Membrane basale à la matrice de tissu conjonctif sous - jacente. Ce Kit Human col15a1 Immunoassay est un test ELISA sandwich en phase solide en trois étapes pour mesurer le col15a1 humain dans les surnageants, le sérum et le plasma de culture cellulaire. Le kit contient E. coli exprimant le col15a1 humain Recombinant et des anticorps produits contre la protéine recombinante. Les résultats obtenus avec le col15a1 humain naturel présentent une courbe linéaire parallèle à la courbe standard obtenue avec les étalons Recombinants. Ces résultats montrent que ce kit peut être utilisé pour déterminer les valeurs relatives de masse du col15a1 humain naturel.

Principe de détection

Le kit adopte la méthode sandwich à double anticorpsTechnique ELISA: les paquets d'anticorps de capture sont placés sur une plaque enzymatique, le col15a1 à tester est capturé dans l'échantillon et les étalons, après le nettoyage d'incubation, puis les anticorps de détection marqués sont ajoutés pour le nettoyage post - incubation, formant le complexe immunologique "anticorps de capture - antigène - anticorps de détection", puis la peroxydase de raifort couplée à la streptavidine est ajoutée pour l'incubation, après le nettoyage à la fin de l'incubation, puis le liquide de révélation TMB est ajouté après que la réaction est arrêtée si le bleu est visible dans l'échantillon. Les Constituents libres au cours de la détection ont tous été lavés, la valeur de do a été mesurée à 450 nm à l'aide d'un étalon enzymatique, la profondeur de la couleur et la quantité de la substance à mesurer dans l'échantillon étaient proportionnelles, la concentration de col15a1 dans l'échantillon a été calculée en traçant une courbe standard.

Points opérationnels

1. Lorsque vous mélangez des solutions de protéines, vous devez toujours éviter les cloques. Pour éviter la contamination croisée, la tête du pistolet de pipette doit être remplacée lorsque chaque étalon, échantillon et réactif est ajouté. De plus, chaque réactif doit être utilisé séparément avec le récipient.

2. Assurez - vous que le réactif est ajouté au trou de la plaque sans interruption. Pour assurer des résultats précis, un film de plaque bien scellé doit être collé pendant l'étape d'incubation.

3.lorsque vous utilisez un lave - plaque automatique, ajoutez une période d'immersion de 30 secondes après avoir ajouté le tampon de lavage, ou tournez la plaque de 180 degrés entre les étapes de lavage, ce qui peut améliorer la précision de la détermination.

4. L'agent de rendu des couleurs doit rester incolore jusqu'à ce qu'il soit ajouté à la plaque. Assurez - vous que l'agent de rendu des couleurs n'est pas exposé à la lumière. L'agent de rendu des couleurs doit changer d'incolore en bleu.

5. Le liquide de terminaison doit être ajouté à la plaque dans le même ordre que l'agent de rendu des couleurs. Après avoir ajouté le liquide de terminaison, la couleur formée dans les trous passera du bleu au jaune. Les pores verts indiquent que le liquide de terminaison n'est pas bien mélangé avec la solution de matrice.

Autres matériaux nécessaires

1. L'étalon enzymatique, y compris la longueur d'onde de dosage de 450 nm, tout en comprenant la longueur d'onde de correction de 600 - 680 nm est meilleure;

2. Pipettes et têtes de pistolet;

3. Eau distillée ou désionisée;

4. Cylindre gradué de 100 - 1000 ml;

5. Bouteille de lavage, pistolet d'échappement ou machine automatique de nettoyage de microplaques;

6. Oscillateur à microplaques à piste horizontale, capable de maintenir une vitesse de 500 ± 50 tr / min;

7. Tubes à essai pour la dilution des normes et des échantillons.

CollagèneKit humain alpha - 1 XV (col15a1)
Précautions

1. Le liquide de terminaison fourni par ce kit est une solution diluée d'acide sulfurique qui a une certaine corrosivité et doit être manipulé avec prudence.

2. Certains ingrédients de ce kit contiennent des conservateurs qui peuvent provoquer des réactions allergiques cutanées, le masque doit être porté pour éviter l'inhalation de la brume.

3. L'agent de rendu des couleurs B peut provoquer une irritation de la peau, des yeux et des voies respiratoires et doit être muni d'un masque pour éviter d'inhaler la brume.

4. Portez des gants de protection, des protecteurs des yeux et du visage et lavez - vous les mains après le traitement.

Préparation des réactifs

1. Placez tous les réactifs à l'équilibre à température ambiante pendant environ 30 minutes avant utilisation.

Configuration du liquide de lavage / diluant: si le liquide de lavage / diluant (20 ×) a un dégagement de cristaux, il doit être chauffé à 37 ° c ⾄ les cristaux sont tous dissous. Diluer avec de l'eau distillée 1: 20 (exemple: 1 ml de liquide de lavage concentré dans 19 ml d'eau distillée)

Configuration standard

Retirer les standards dans le kit, préparer7 tubes, d'abord à partir de4 μg/mlStandard (200 µl) on prélève à la demande une quantité diluée à 200 ng / ML avec une dilution 1x (example: 50 µl de solution mère étalon + 950 µl de dilution 1x donnant 1000 µl d'étalon de concentration 200 ng / ML), puis on ajoute 500 µl de dilution 1x dans chacun des 6 Tubes à essai, dans lesquels on dilue successivement 200 ng / ml d'étalon 2 fois à 6 gradients, pour un total de 7 concentrations d'étalon, successivement:200%, 100%, 50%, 25 ng / ML, 12,5 ng / ML, 6,25 ng / ML,Aspirer à partir d'une solution de norme de concentration500 μl de l'étalon dans le tube à essai suivant, mélanger doucement par soufflage et ainsi de suite pour effectuer une dilution multipliée par deux de l'étalon (comme indiqué sur la figure), 1 x dilution utilisée comme étalon à concentration nulle (0 ng / ML)

Calcul des résultats

Calcul de la moyenne des pores standard et échantillonValeur od et soustraire la valeur od du trou vide comme valeur de correction. Avec la concentration en abscisse et la valeur od en ordonnée, une courbe standard de la fonction logique à quatre paramètres est tracée sur du papier de coordonnées (les valeurs des groupes vides sont supprimées lors de la composition du diagramme) ou une courbe standard est créée à l'aide d'un logiciel informatique capable de générer un ajustement de courbe logique à quatre paramètres (4 - p). Si la valeur od de l'échantillon est supérieure à la limite supérieure de la courbe standard, elle doit être réévaluée après dilution appropriée et multipliée par le multiple de dilution correspondant lors du calcul de la concentration de l'échantillon.- Oui.

Exemples de données

Les données et les courbes suivantes sont fournies à titre indicatif seulement, et les expérimentateurs doivent établir une courbe standard basée sur leurs propres données expérimentales.

La courbe standard illustrée sur cette figure est à titre d'exemple seulement, le calcul des résultats doit être basé sur la courbe standard tracée pour la même norme d'essai pour calculer le résultat de l'échantillon.
sensibilité

Testé sur échantillon, la sensibilité de détection de ce kit està 1,56 ng/ml.

Spécificité

Ce kit de détermination identifie les personnes naturelles et reconstituéesCOL15A1- Oui.

D'autres protéines pertinentes sont préparées en tampon de dilution comme50ng/mL， Et déterminer la réactivité croisée. Aucune réaction croisée significative n'a été observée.

Résumé des étapes expérimentales
Ajouter les normes et les échantillons, 37 ℃ réaction à l'abri de la lumière 1,5 H, laver 3 fois.

2. Ajout d'anticorps de détection,37°c réaction à l'abri de la lumière pendant 1H, lavage 4 fois.

3. Addition de conjugués enzymatiques,37°c réaction à l'abri de la lumière pendant 30 minutes, lavage 4 fois.

4. Ajouter le liquide de rendu des couleurs, 37 ℃ réaction à l'abri de la lumière pendant 15 minutes.

5. Ajoutez le liquide de terminaison, lisez dans les 5 minutes

personneCollagèneα-1 XV(COL15A1)Kit pour la détection quantitative du surnageant de culture cellulaire, sérum, plasma humainCOL15A1, cette notice doit être lue dans son intégralité avant d'utiliser ce produit, personnesLe kit ELISA est destiné à la recherche scientifique et ne peut pas être utilisé pour d'autres diagnostics- Oui.