Lors de la culture de cellules périvasculaires microvasculaires humaines, le choix du milieu et les détails de la manipulation affectent directement l'état de croissance des cellules et la fiabilité des résultats expérimentaux. Voici une description supplémentaire de quelques considérations clés:

1. Qualité du sérum et stabilité du lot

Si vous utilisez un milieu de culture contenant du sérum (p. ex. dmem avec 10% de FBS), vous devez vous assurer que la source de sérum est fiable et éviter la contamination par mycoplasmes ou endotoxines. Il peut y avoir des différences dans les facteurs de croissance entre les différents lots de sérum et il est recommandé d'effectuer un test de lot préalable ou de choisir un milieu sans sérum pour réduire les variables.

2. Stratégie de supplémentation en facteurs de croissance

Les péricytes sont sensibles aux facteurs de croissance tels que PDGF - BB, bFGF, etc., mais des concentrations trop élevées peuvent entraîner une prolifération excessive ou un décalage de différenciation. Il est recommandé de déterminer la proportion optimale d'addition par pré - expérimentation et de changer régulièrement le milieu fraîchement formulé (approprié tous les 2 - 3 jours).

3. Régulation de la tension d'oxygène

Les cellules périvasculaires microscopiques sont dans un microenvironnement à faible teneur en oxygène (1 - 5% o₂) in vivo et les incubateurs conventionnels (21% o₂) peuvent déclencher un stress oxydatif. L'utilisation d'un incubateur à trois gaz pour simuler les conditions physiologiques de l'oxygène peut être envisagée, ou l'ajout d'antioxydants pour atténuer les dommages causés par l'hyperoxie.

4. Optimisation du paquet de substrat

Les cellules sont dépendantes des protéines matricielles et il est recommandé d'utiliser des paquets de collagène IV ou de fibronectine pour les boîtes de pétri, mais il est nécessaire de faire attention à la concentration des paquets (généralement 5 - 10 μg / cm²). L'Encapsulation excessive est susceptible de modifier les caractéristiques de migration cellulaire.

5. Prévention et contrôle des risques de pollution

Les péricytes sont sensibles à la contamination par les fibroblastes et la pureté peut être régulièrement identifiée par immunofluorescence cd146 ou par coloration ng2. Si une contamination est détectée, essayez la méthode de paroi différentielle ou le tri en flux pour la purification.

6. Raffinement des opérations de passage

Une faible concentration (0,05%) associée à une brève incubation (2 - 3 minutes) est recommandée lors de la digestion, neutralisée à temps avec un milieu contenant du sérum. Le ratio de passage est contrôlé entre 1: 2 et 1: 3, évitant le vieillissement causé par une densité cellulaire trop faible en un seul passage.

7. Précautions pour la congélation et la récupération

Le lyophilisat doit contenir 10% de DMSO et une concentration élevée de sérum (par exemple, 90% de FBS), l'azote liquide étant conservé après refroidissement du programme. L'échange de liquide après réanimation doit être effectué dans les 24 heures pour éliminer le DMSO résiduel.

Avec le contrôle détaillé ci - dessus, la répétabilité et la précision des données d'étude fonctionnelles de la culture péricytaire peuvent être considérablement améliorées. Lors d'expériences ultérieures telles que la co - culture ou la construction de modèles angiogéniques, la détection synchrone de marqueurs tels que l'alpha - SMA et desmin est recommandée pour confirmer la stabilité phénotypique des cellules.