Pour optimiser l'efficacité de détection de la PCR conventionnelle, en plus d'optimiser le système réactionnel et la conception des amorces, il est nécessaire de se concentrer sur l'ajustement fin de la procédure d'amplification. Voici quelques stratégies clés:

1. Gradient PCR détermine la température de recuit optimale
La température de recuit est essentielle à la spécificité d'amplification. La température de recuit peut être rapidement filtrée par PCR Gradient (par exemple Gradient réglé à 50°C - 65°c) pour éviter les bandes non spécifiques ou les échecs d'amplification. Si les valeurs de TM de l'amorce diffèrent fortement, on peut essayer la "PCR Touchdown", c'est - à - dire la réduction progressive de la température de recuit à partir d'une température plus élevée, en amplifiant préférentiellement les produits hautement spécifiques.

2. Optimisation des paramètres de cycle
- temps de pré - dénaturation: pour les gabarits à haute teneur en GC, la dénaturation initiale peut être prolongée jusqu'à 5 - 10 minutes, assurant la délinéation de l'ADN.
- durée d'élongation: ajustée en fonction de la longueur du fragment amplifié (généralement calculée à 1 KB / min), sous réserve des différences d'activité enzymatique. Par exemple, les enzymes haute fidélité peuvent prendre plus de temps.
- nombre de cycles: l'amplification conventionnelle recommande 25 - 35 cycles. Trop de cycles peuvent augmenter le risque de dimère d'amorce et peuvent équilibrer la sensibilité avec la spécificité en diluant le gabarit ou en réduisant le nombre de cycles.

3. Utilisation des additifs
- DMSO ou bétaïne: atténue les effets des structures secondaires complexes, en particulier pour les fragments longs ou les modèles GC élevés (concentration finale recommandée de 3 à 5%).
- Optimisation de la concentration en mg²: le mg² est un Cofacteur de l'enzyme Taq dont la concentration (généralement 1,5 - 2,5 mm) doit être équilibrée avec les dNTP. La concentration optimale peut être déterminée par des expériences de gradient espacées de 0,5 mm.

4. Qualité et quantité du modèle
Évitez les modèles qui dégradent ou contiennent des inhibiteurs. Si l'échantillon est de l'ADN ambiant, une étape de prétraitement (p. ex. purification sur colonne) peut être ajoutée. La quantité de gabarit est recommandée entre 1 et 100 ng, trop peut entraîner une amplification non spécifique, trop peu peut entraîner une augmentation du nombre de cycles.

5. Paramètres de contrôle
Les contrôles positifs (gabarits connus), les contrôles négatifs (sans gabarit) et les contrôles internes (par exemple, le gène steward) sont inclus pour exclure la contamination par les réactifs ou les anomalies du système.