Le principe de l'ELISA

La base de l'ELISA est la solidification d'antigènes ou d'anticorps et le marquage enzymatique d'antigènes ou d'anticorps. L'antigène ou l'anticorps lié à la surface du support en phase solide conserve encore son activité immunologique, l'antigène ou l'anticorps marqué par l'enzyme conservant à la fois son activité immunologique et celle de l'enzyme. Au moment de l'essai, le spécimen examiné (dans lequel l'anticorps ou l'antigène est déterminé) réagit avec l'antigène ou l'anticorps à la surface du support en phase solide. Le complexe antigène - anticorps formé sur le support en phase solide est séparé des autres substances dans le liquide par une méthode de lavage. L'antigène ou l'anticorps marqué par l'enzyme est ajouté à nouveau, également lié par réaction sur le support en phase solide. La quantité d'enzyme sur la phase solide à ce moment - là est proportionnelle à la quantité de substance examinée dans le spécimen. Après l'ajout du substrat de la réaction enzymatique, le substrat est catalysé par l'enzyme en un produit coloré, la quantité de produit étant directement liée à la quantité de substance examinée dans le spécimen, de sorte qu'elle peut être analysée qualitativement ou quantitativement en fonction de la profondeur de la couleur. En raison de l'efficacité catalytique élevée de l'enzyme, les résultats de la réaction immunitaire sont indirectement amplifiés, ce qui rend la méthode de dosage très sensible.

II. Types d’elisa

ELISA peut être utilisé pour la détermination des antigènes, mais aussi pour la détermination des anticorps. Il y a trois réactifs nécessaires dans cette méthode de dosage: (1) Un antibactérien ou un anticorps en phase solide, c'est - à - dire un "immunosorbant" (Immunosorbent); (2) un antigène ou un anticorps marqué par une enzyme, appelé « conjugué»; (3) substrat de la réaction enzymatique. Différents types de méthodes de détection peuvent être conçus en fonction de l'origine du réactif et de la situation du spécimen, ainsi que des conditions spécifiques de la détection. Il existe principalement plusieurs types d’elisa utilisés pour l’examen clinique:

1. Test de l'antigène par la méthode sandwich à double anticorps

La méthode sandwich à double anticorps est une méthode couramment utilisée pour détecter l'antigène Zui, les étapes opératoires sont les suivantes:

1) Lier l'anticorps spécifique avec un vecteur de phase solide pour former un anticorps de phase solide. Le lavage élimine les anticorps non liés et les impuretés.

2) Ajouter le spécimen examiné, réaction d'isolation thermique. L'antigène dans le spécimen se lie aux anticorps en phase solide pour former un complexe d'anticorps antigène en phase solide. Le lavage élimine les autres substances non liées.

3) Ajouter des anticorps de marque enzymatique, réaction d'isolation thermique. L'antigène sur le complexe immunitaire en phase solide se lie à l'anticorps marqueur de l'enzyme. * lavage des anticorps marqueurs enzymatiques non liés. La quantité d'enzyme portée sur le support en phase solide à ce moment - là est liée à la quantité d'antigène examiné dans le spécimen.

4) plus le substrat rend la couleur. Les enzymes sur la phase solide catalysent le substrat pour devenir un produit coloré. Par colorimétrie, la quantité d'antigène dans le spécimen est mesurée.

Dans les tests cliniques, cette méthode s'applique à l'examen d'antigènes macromoléculaires tels que diverses protéines, telles que HBsAg, HBeAg, AFP, HCG, etc. Cette méthode peut être établie pour l'encapsulation de vecteurs en phase solide et la préparation de conjugués enzymatiques, à condition d'obtenir des anticorps hétérosexuels dirigés contre l'antigène examiné. Si la source d'anticorps est l'antisérum, les anticorps encapsulés et étiquetés par l'enzyme sont prélevés séparément sur des animaux de genres différents. Comme dans le cas de l'application d'anticorps monoclonaux, on choisit généralement deux anticorps monoclonaux dirigés contre différents déterminants de l'antigène, respectivement pour l'encapsulation du vecteur en phase solide et la préparation de conjugués enzymatiques. Cette méthode de sandwich à deux sites est très spécifique et permet d'isoler les échantillons testés et les anticorps marqueurs de l'enzyme dans une réaction de chaleur pour un test en une étape. Dans un test en une étape, lorsque le contenu de l'antigène examiné dans le spécimen est élevé, l'antigène en excès se lie respectivement à l'anticorps en phase solide et à l'anticorps marqueur enzymatique sans former de « complexe sandwich». Semblable au phénomène de la bande arrière de l'excès d'antigène dans la réaction de précipitation, à ce moment - là, la valeur d'absorption lumineuse du rendu de couleur après la réaction (située sur la bande d'excès d'antigène) est identique à la valeur d'absorption lumineuse de la courbe standard (située sur la bande d'excès d'anticorps) pour une certaine concentration d'antigène, tel que mesuré par la méthode normale, le résultat résultant sera inférieur à la teneur réelle, ce phénomène est appelé effet crochet (hookeffect), car la courbe standard atteint un pic avec une courbe crochet. Lorsque l'effet crochet est sévère, la réaction peut même produire des résultats faussement négatifs sans coloration. Par conséquent, lors de l'utilisation d'un réactif en une étape pour déterminer les substances dont le contenu peut être anormalement élevé dans un spécimen (par exemple, HBsAg dans le sérum, AFP et HCG dans l'urine, etc.), il convient de prêter attention aux valeurs zui élevées de la plage mesurable. La préparation de tels réactifs avec des anticorps monoclonaux de haute affinité atténue l'effet crochet. En supposant que plusieurs déterminants identiques, par example le déterminant a de l'HBsAg, soient présents sur différents sites de la molécule testée, il est également possible d'encapsuler le même monomab déterminé à cet effet en phase solide et de préparer des conjugués enzymatiques respectivement. Mais dans la détection de l'AG HBs devrait prêter attention au problème de sous - type, AG HBs a ADR, AdW, Ayr, ayw4 sous - types, bien que chaque sous - type a la réactivité du même déterminant a, qui est également un problème à surveiller avec la méthode de sandwich à l'aide d'un réactif simple. Un autre point d'intérêt pour la mesure des antigènes par la méthode sandwich à double anticorps est l'interférence du facteur rhumatoïde (RF). RF est un auto - anticorps, de type IgM, capable de se lier au segment FC de nombreuses IgG animales. Si un échantillon de sérum utilisé comme test sandwich à double anticorps contient du R f, il peut agir comme composant antigénique tout en se liant à des anticorps en phase solide et à des anticorps de référence enzymatique présentant une réponse faussement positive. Les fragments F (ab ') ou FAB sont utilisés comme réactifs pour les conjugués enzymatiques, ce qui élimine les interférences RF dues à l'élimination du segment FC. Si le réactif ELISA de la méthode sandwich à double anticorps est affecté par RF a été répertorié comme un indicateur d'évaluation pour ce type de réactif. La méthode du sandwich à deux anticorps s'applique à la détermination d'antigènes macromoléculaires bivalents ou supérieurs, mais ne s'applique pas à la détermination d'antigènes monovalents à demi - antigènes et à petites molécules, car ils ne peuvent pas former de sandwich à deux sites.

2. Test d'anticorps par la méthode sandwich à double antigène

Le mode réactionnel est similaire à la méthode de sandwich à double anticorps. L'Encapsulation est réalisée avec des antigènes spécifiques et des conjugués enzymatiques sont préparés pour détecter les anticorps correspondents. La différence avec les anticorps de la méthode indirecte est le remplacement des anticorps enzymatiques par des antigènes enzymatiques. Les spécimens examinés dans cette méthode ne nécessitent pas de dilution et peuvent être utilisés directement pour la détermination, de sorte que leur sensibilité est relativement plus élevée que dans la méthode indirecte. Cette méthode est souvent utilisée pour la détection d'anti - HBs dans les marqueurs de l'hépatite B. La clé de cette méthode réside dans la préparation de l'antigène étalon enzymatique et il convient de rechercher des méthodes de marquage appropriées en fonction de la structure de l'antigène.

3. Test indirect des anticorps

La méthode indirecte est une méthode couramment utilisée pour détecter les anticorps. Le principe est d'utiliser des anticorps anti - enzymatiques marqués (anticorps anti - immunoglobulines humaines) pour détecter les anticorps testés qui se lient à un antigène en phase solide, alors appelé méthode indirecte (voir figure 2 - 3). Les étapes de fonctionnement sont les suivantes:

1) Lier l'antigène spécifique avec le support de phase solide pour former l'antigène de phase solide. Le lavage élimine les antigènes non liés et les impuretés.

2) Ajouter le sérum testé dilué, réaction d'isolation thermique. Les anticorps spécifiques dans le sérum se lient à l'antigène en phase solide pour former un complexe d'anticorps antigène en phase solide. Après lavage, seuls les anticorps spécifiques restent sur le support de phase solide et les autres Constituents du sérum sont lavés au cours du lavage.

3) ajout d'anticorps anti - enzymatiques. Les marqueurs enzymatiques anti - IG humaines sont disponibles pour détecter les anticorps totaux, mais les anticorps IgG sont généralement détectés avec des marqueurs enzymatiques anti - IgG humaines. Les anticorps dans le complexe immunitaire en phase solide se lient aux anticorps marqueurs de l'enzyme, marquant ainsi indirectement l'enzyme sur elle. Après lavage, la quantité d'enzyme sur le support en phase solide est positivement corrélée à la quantité d'anticorps testés dans le spécimen.

4) colorimétrie Additive substrat cette méthode est principalement utilisée pour le diagnostic des maladies infectieuses pour la détection d'anticorps pathogènes.

L'avantage de la méthode indirecte est qu'une méthode de détection de l'anticorps correspondent peut être établie à l'aide d'un même anticorps anti - enzymatique tant que l'antigène est encapsulé par transformation. La clé du succès de la méthode indirecte réside dans la pureté de l'antigène. Bien qu'il soit parfois possible d'obtenir des résultats pratiques et efficaces en Encapsulant l'antigène grossier, il convient de le purifier autant que possible pour améliorer la spécificité du test. Une attention particulière doit être accordée à l'élimination des impuretés susceptibles de réagir avec le sérum humain sain en général, telles que les antigènes Recombinants avec E. coli comme enzyme d'ingénierie, tels que ceux contenant le composant E. coli, qui peuvent très bien réagir avec les anticorps anti - E. Coli dans le sang des personnes infectées par E. coli. Les antigènes ne peuvent pas non plus contenir de substances qui réagissent avec des marqueurs enzymatiques contre les IG humaines, par exemple des antigènes du plasma humain ou des tissus humains, si les IG ne sont pas éliminées, des réactions faussement positives se produisent également dans le test. En outre, si l'antigène contient une protéine indépendante, il peut également affecter l'effet du paquet en raison de l'adsorption contestée. Un autre facteur perturbateur dans la méthode indirecte est la non - spécificité des concentrations élevées contenues dans le sérum normal. Les IgG spécifiques testées dans le sérum des patients ne représentent qu'une petite fraction des IgG totales. L'adsorption des IgG est forte et les IgG non spécifiques peuvent être adsorbées directement sur le support en phase solide et parfois aussi à la surface de l'antigène encapsulé. Ainsi, dans la méthode indirecte, l'inclusion de l'antigène est généralement suivie d'une reconditionnement avec une protéine indépendante (par exemple, une protéine de sérum bovin) pour fermer (bloquer) les espaces vides sur la phase solide. En outre, les échantillons doivent être dilués au préalable (1: 40 ~ 1: 200) pendant le test pour éviter un fond négatif trop élevé qui affecte le jugement des résultats.

4. Test des anticorps par la loi sur la concurrence

Cette méthode peut détecter des anticorps spécifiques lorsque la substance interférente dans la matière antigénique n'est pas facilement éliminée ou lorsqu'il n'est pas facile d'obtenir suffisamment d'antigène purifié. Le principe est que les anticorps et une certaine quantité d'anticorps étalons enzymatiques dans un spécimen rivalisent pour se lier à un antigène en phase solide. Plus la quantité d'anticorps dans le spécimen est importante, moins il y a d'anticorps de référence enzymatiques liés à la phase solide, de sorte que la réponse positive est plus claire que la réponse négative. Si l'antigène est de haute pureté, il peut être directement encapsulé dans la phase solide. Si l'antigène aura des substances interférentes, l'inclusion directe n'est pas facile à réussir, la méthode d'inclusion de capture peut être adoptée, c'est - à - dire d'abord l'inclusion de l'anticorps correspondant à l'antigène de phase solide, puis l'ajout de l'antigène pour former l'antigène de phase solide. Le lavage élimine les impuretés de l'antigène, puis l'échantillon et l'anticorps étalon de l'enzyme sont ajoutés pour une réaction de liaison compétitive. Il existe de nombreux modes de test des anticorps par la méthode de compétition, qui peuvent lier des échantillons et des anticorps marqueurs enzymatiques à des antigènes en phase solide, généralement utilisés par ELISA anti - HBC. Un autre mode consiste à ajouter le spécimen à l'anticorps en phase solide avec l'antigène pour la liaison compétitive, puis à ajouter l'anticorps étalon enzymatique après le lavage pour réagir avec l'antigène lié à la phase solide. Cette méthode est généralement utilisée pour la détection de l'anti - HBe.

5. Mesure des antigènes par le droit de la concurrence

L'antigène de petite molécule ou la cause semi - résistante manque de plus de deux sites qui peuvent être utilisés comme méthode sandwich, de sorte qu'il ne peut pas être déterminé par la méthode sandwich à double anticorps et peut être utilisé en mode compétitif. Le principe est que l'antigène dans le spécimen et une certaine quantité d'antigène étalon enzymatique rivalisent pour se lier aux anticorps en phase solide. La quantité d'antigène est plus élevée dans les spécimens, moins l'antigène de référence enzymatique est lié à la phase solide et plus le rendu des couleurs après zui est clair. Petites molécules d'hormones, de médicaments et d'autres tests ELISA Multi - utiliser cette méthode.

6. Pack de capture testé anticorps

La détection des anticorps IgM est utilisée dans le diagnostic précoce des maladies infectieuses. La méthode indirecte ELISA est généralement réservée à la détection des anticorps totaux ou des anticorps IgG. Si les anticorps IgM sont déterminés directement par la méthode indirecte de l'encapsulation de l'antigène, en raison de la présence généralement simultanée d'une concentration plus élevée d'anticorps IgG dans l'échantillon, ce dernier sera compétitif pour se lier à l'antigène de phase solide, de sorte qu'une partie des anticorps IgM ne peut pas se lier à la phase solide. Ainsi, si l'on détermine indirectement les anticorps IgM avec des anticorps anti - IgM humaines en tant que di - anticorps, il faut d'abord traiter le spécimen avec la protéine a ou avec des anticorps anti - IgG pour éliminer l'interférence des IgG. La méthode du package de capture est utilisée lors de la détermination des anticorps IgM dans les tests cliniques. La phase solide est d'abord encapsulée avec des anticorps anti - IgM humains pour capturer les IgM dans les échantillons de sérum (qui comprennent des anticorps IgM spécifiques contre l'antigène et des IgM non spécifiques). On ajoute ensuite l'antigène qui se lie uniquement aux IgM spécifiques. L'enzyme est ensuite ajoutée pour marquer les anticorps spécifiques dirigés contre l'antigène. En relation avec le substrat, la coloration est positivement corrélée avec les IgM dans le spécimen. Cette méthode est couramment utilisée pour le diagnostic précoce des infections virales. Voir la figure 2 - 7 pour le mode de détection des anticorps contre le virus de l'hépatite A (VHA). Le facteur rhumatoïde (RF) peut également interférer avec la détection des anticorps IgM par la méthode de capture des paquets, ce qui entraîne une réponse faussement positive. Par conséquent, la méthode indirecte de neutralisation des IgG a récemment été privilégiée et la détection des anticorps iggm anti - CMV et IgM anti - Toxoplasma avec ce type de réactif a été couronnée de succès.

7. Loi ABS - ELISA

ABS est le diminutif du système avidin - biotine. L'avidine est une glycoprotéine d'un poids moléculaire de 60 000, chaque molécule étant composée de 4 sous - unités liées à l'énergie et à la biotine. La biotine est un composé de petite molécule de poids moléculaire 244. L'ester de protéine - hydroxysuccinimide dérivé fabriqué chimiquement peut former des produits marqués à la biotine avec de nombreux types de molécules de taille, telles que les protéines et les sucres, et la méthode de marquage est facile. La liaison de la biotine à l'avidine est très spécifique, son affinité est beaucoup plus réactive que celle des anticorps antigéniques et les deux sont extrêmement stables une fois liés. Étant donné qu'une affinine peut se lier à quatre molécules de biotine, la méthode ABS et Elisa peut être divisée en deux types: la méthode Lab (enzyme marked Affinity - biotine) et la méthode ABC (Bridge Affinity - biotine). Les deux remplacent les anticorps (antigènes) marqués à la biotine par des anticorps (antigènes) marqués à l'enzyme dans le système ELISA original. Dans le Lab, la biotine en phase solide réagit d'abord avec une avidine non marquée, puis est additionnée d'une biotine marquée enzymatiquement pour améliorer encore la sensibilité. À un stade précoce, l'avidine, qui est une glycoprotéine alcaline très adsorbante sur un support en polystyrène, est extraite du blanc d'œuf et son utilisation en ELISA augmente le fond. La streptavidine extraite de Streptomyces n'a pas cet inconvénient et a tendance à remplacer la première dans les applications ELISA. Comme l'ABS - ELISA utilise deux réactifs de plus que l'ELISA ordinaire, ce qui augmente le nombre d'étapes opérationnelles, il n'y a pas beaucoup d'applications d'ABS - ELISA dans l'examen clinique.