Après l'isolement et la culture des fibroblastes d'origine tissulaire du cancer de l'œsophage humain, une identification et une analyse fonctionnelle supplémentaires des cellules sont nécessaires pour s'assurer que leurs caractéristiques biologiques sont conformes aux exigences expérimentales. Voici les étapes opérationnelles clés suivantes:

1. Observation de la morphologie cellulaire

- observer régulièrement la morphologie cellulaire à l'aide d'un microscope inversé. Les fibroblastes primaires ont généralement une forme fusiforme ou polygonale, avec une croissance des parois et une bonne extension cytoplasmique. En cas d'apparition de cellules flottantes circulaires ou d'agrégations anormales, qui peuvent suggérer une contamination ou un mauvais état cellulaire, les conditions de culture doivent être réévaluées.

2. Identification par immunofluorescence

- coloration immunofluorescente par des marqueurs spécifiques tels que vimentin, alpha - SMA. Les fibroblastes devraient exprimer vimentin à un niveau élevé, tandis que le taux de positivité alpha - SMA peut refléter son degré d'activation. Prenez soin de mettre en place un contrôle homotype pour exclure les liaisons non spécifiques.

3. Expérience de vérification fonctionnelle

- test de capacité proliférative: l'activité proliférative cellulaire est évaluée par la méthode CCK - 8 ou edu, comparant les différences entre les fibroblastes paracancéreux et d'origine cancéreuse.

- analyse de la sécrétion de collagène: détection du niveau de sécrétion de collagène de type I / I par ELISA ou Western Blot, en précisant sa capacité pro - fibrotique.

- expériences de co - Culture: des fibroblastes ont été co - cultivés avec des lignées cellulaires de cancer de l'œsophage telles que kyse - 150 pour observer leur effet sur la migration invasive des cellules cancéreuses (comme dans l'expérience transwell).

4. Congélation et récupération

- sélection des cellules en phase de croissance logarithmique, fractionnées dans un lyophilisateur avec un lyophilisat contenant 10% de DMSO, puis passage à l'azote liquide après refroidissement programmé. Le bain - Marie rapide fond au moment de la réanimation, le lyophilisat est éliminé par centrifugation, remis en suspension avec du milieu sérique à haute concentration et la solution est changée après 24 heures.

Précautions

- opération strictement stérile pour éviter la contamination par Mycoplasma;

- le nombre de passages cellulaires primaires est recommandé de ne pas dépasser 5 générations en cas de dérive phénotypique;

- les expériences fonctionnelles doivent être répétées plus de 3 fois pour assurer la fiabilité des données.